药敏试验培养基
无添加成分的MH琼脂，适用于非苛养菌。
添加5%机械脱纤维马血及20 mg/ Lβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)的MH琼脂(MH-F,Mueller-Hinton Fastidious),适用于苛养菌。
β-NAD纯度≥98%。

自制培养基

MH-F培养基需在冷却至42-45℃后再添加血液或β-NAD，然后充分混匀。
在水平面上倾注平板，培养基厚度4.0±0.5 mm.如果琼脂厚度在可接受范围内但持续高于或低于4mm，则需调整琼脂体积。
不同平板所需的培养基大致体积：90mm圆形平板25ml,100mm圆形平板31ml，150mm圆形平板71ml,100mm方形平板40ml。制造商之间平板尺寸可能不同。应基于所使用的培养皿真实尺寸，计算出所需培养基正确的体积。

MH琼脂平板质量控制
检测每个新批次MH琼脂平板，确保所有抗菌药物抑菌圈都在EUCAST质量控制范围之内。
特殊问题:
1、铜绿假单胞菌ATCC 27853对氨基糖苷类药物的抑菌圈低于/超出质控下限或上限，表明二价阳离子浓度过高或过低。
2、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑对粪肠球菌ATCC 29212的抑菌圈范围低于质控下限，表明胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷在培养基中浓度过高。

琼脂平板干燥和储存
1、自制平板：4-8℃储存。平板的干燥、储存条件及有效期根据实验室实际情况而定。
2、商品化平板：按照制造商建议储存。在标注的有效期之内使用

琼脂平板干燥和储存
确保琼脂平板在接种前恢复至室温。
琼脂表面使用前应干燥。
过多的水分可能引起抑菌圈边缘模糊和/或抑菌圈内部薄雾状生长。
琼脂表面或盖子里面不应看见水滴。当用塑料袋或密封容器储存平板时经常看见这种情况。
必要时可以20-25℃过夜干燥平板，或者打开盖子35℃放置15分钟。
不要过度干燥平板。

接种物

该方法需要相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液 大约相当于1-2×108CFU/mL的大肠埃希菌

接种物制备

使用无菌环或棉拭子从非选择性培养基上挑选过夜培养的菌落。如果可能，挑选几个形态相似的菌落，避免选择不典型的变异株。
在盐水中混悬并混匀。通过添加盐水或挑取更多的细菌来调整菌悬液至0.5麦氏浊度。最好使用比浊仪来测量浊度。
例外：血琼脂平板上的肺炎链球菌混悬至0.5麦氏浊度，而巧克力琼脂平板上的肺炎链球菌应混悬至1.0麦氏浊度

平板接种

制备的菌悬液最好在15分钟内使用，通常在60分钟之内使用。确保平板在接种前恢复至室温。用无菌棉拭子蘸取菌悬液。对于革兰阴性细菌，可以通过在管壁内侧按压和旋转拭子来去除多余液体，避免过量接种。对于革兰阳性细菌，不要在管壁内侧按压或旋转拭子

药敏纸片的储存

按照制造商说明书保存未开封纸片和正在使用的纸片。有些药物相对其它药物更不稳定，可能有特殊的保存推荐规范。正在使用的纸片应置于含干燥指示剂的密闭容器内，避光保存。为了防止冷凝，在打开容器前让纸片恢复至室温。如果一天当中多次使用药敏纸片，室温保存要优于反复冻融。不要使用超过厂商规定有效期的纸片。

药敏纸片的使用
接种15分钟内贴纸片。纸片必须紧贴在琼脂表面。为了避免抑菌圈的重叠和药物之间的相互干扰，应当限制平板上贴的纸片数量。重要的是能够可靠地测量抑菌圈直径。

平板的孵育
翻转琼脂平板以确定纸片不会从琼脂表面脱落。在贴纸片后15分钟内，孵育平板。由于受热不均匀，在孵育箱内叠放平板可能会影响结果。尽管培养箱性能不同，但对于大多数培养箱来说，每堆最多放5个平板较为合适。
35±1℃空气孵育MH平板。
35±1℃4-6%CO孵育MH-F平板(弯曲菌例外)

平板的孵育

15-15-15分钟原则

纸片扩散法操作请按照以下说明：

菌悬液最好在制备后15分钟内接种，通常不得超过60分钟。

接种后15分钟内贴纸片。

贴纸片后15分钟内孵育平板。

孵育后平板的检查

正确接种和完美划线会使菌落均匀生长。生长物在琼脂表面均匀分布才能形成规整的圆形(非锯齿状)抑菌圈。如果见到单个菌落，说明接种物浓度太低，必须重复试验。

抑菌圈判读

将平板置于距眼睛约30厘米处，用肉眼判读完全抑制处为抑菌圈边缘。将MH平板置于黑色背景，用反射光照明，从平板背面判读。判读MH-F平板，用反射光照明，移开盖子，从正面判读

除非另有说明，不要使用透射光(将平板朝向光源)或放大镜。当难以确定抑菌圈的边缘时，将平板与工作台成45度角放置后再阅读可能有助于判读。采用直尺或游标卡尺测量抑菌圈直径，四舍五入到毫米数。如果使用自动抑菌圈判读仪，必须和手工判读法校准。如果出现双圈，或在抑菌圈内有明显的差异菌落时，应检查菌落纯度，如有必要则重复试验。如果是纯培养，测量直径时应考虑抑菌圈内的菌落。

抑菌圈判读-特殊情况

抑菌圈解释

在进行结果解释之前，检查质控菌抑菌圈直径在可接受范围内。

根据目前的EU CAST折点表格，将抑菌圈直径解释敏感性分类(敏感、中介和耐药) 。或者使用含EU CAST折点的模板进行报告。

药物敏感性试验的质量控制

使用推荐的常规质控菌株来监测试验性能。

对于β-内酰胺类抑制剂复合纸片，推荐特定的产β-内酰胺酶菌株用于抑制剂成分的质量控制。这应是常规质量控制的一部分。活性成分可采用敏感的质控菌株来检测。

具有明确耐药机制的质控菌株可用于确定其检测耐药性的能力。

质控菌株可从菌株保藏中心或商业来源购买。

使用常规质控菌株评估常规操作

作为常规药敏报告的抗菌药物，应每天做质控试验或者每周至少四次。

在对临床菌株报告结果前，应先判读和评估质控试验结果。

每天进行质控实验时，应检查最近的20个连续测试结果。

检查质控结果的趋势以及是否有抑菌圈持续高于或低于靶值的情况。

20次测试中，如有2个或更多测试结果超出质控范围，应进行调查。

对失控结果的处理

如果20次测试中出现两次非连续的抑菌圈直径结果失控—那么报告药敏试验结果，并进行调查。

如果20次测试中出现两次连续的抑菌圈直径结果失控那么报告药敏试验结果之前要先调查。这些测试可能需要复检。

如果在某一天多个药敏纸片(>2)失控—那么报告药敏试验结果之前要先调查。这些测试可能需要复检。

如果耐药质控菌株未检测出耐药性一那么禁止报告药敏试验结果，进行调查并重复测试

质控菌株的保存和传代

质控菌株用含磁珠甘油肉汤保存管(或市售等效培养基)-70°C保存。每种菌株保存2管，一管使用，一管存档。

每周从使用管中将菌株传代到合适的非选择性培养基上，并检查纯度。

每天从已纯化的平板传代。挑取几个菌落以避免选择突变株。苛养菌只能逐日连续传代培养。

QC菌株最多可传代6天。然后，中制备新的纯化平板。丢弃平板，再从冷冻的使用管

使用管菌株用完后，从存档保存管传代，并用传代培养物制备另一个使用管